Para explorar e identificar variantes en la estructura del ADN método genético molecular usado. Para cada región de ADN, que explora esta región del cromosoma, gen o alelo, los métodos difieren. Subyacente a cada método de genética molecular comprende algunos o otra manipulación de ARN y ADN. Todos estos métodos se caracterizan por una enorme complejidad, sin condiciones de laboratorio no pueden ser llevadas a cabo, y el personal deben estar altamente calificados. Este trabajo se lleva a cabo en varias etapas.
etapas
En primer lugar, las muestras de ARN o de ADN para ser producidos. Aquí, un método genético molecular se puede aplicar a prácticamente cualquier material: una gota de sangre, los leucocitos, fibroblastos cultura, mucosa (raspado), incluso los folículos del pelo, – ADN puede obtenerse de cualquier muestra. Es adecuado para usar cualquiera de los métodos de genética molecular y sus diversas opciones y han largo aislado de ADN se almacena congelado. La segunda etapa está dedicada a la acumulación de los fragmentos deseados (amplificación) de ADN, ya que ayuda a asegurar la reacción en cadena de la polimerasa in vitro (in vitro sin la participación de un organismo vivo). Como resultado, los seleccionados se multiplica fragmento de ADN mediante esta reacción en cadena, y aumenta la cantidad de ADN literalmente millones de veces.
El tercer paso en los métodos de investigación genética molecular se supone restricción multiplicada ADN (esta fragmentación, desgarro o corte). Restricción realizó por electroforesis en un gel de poliacrilamida o agarosa. Este método genético-molecular de estudiar el fragmento de ADN que permite que cada uno para tomar una cierta posición en el gel. A continuación, el gel se trata con bromuro de etidio, capaz de unirse al ADN, la irradiación con luz ultravioleta, entonces es posible observar partes de luminiscencia. los métodos de diagnóstico de genética molecular son variadas y numerosas, pero los dos primeros pasos son comunes a todos. Pero con el fin de identificar fragmentos de ADN, el gel puede ser coloreado, y muchos otros métodos existentes.
especies
Los métodos más directos y generalizadas para micobacterias detección pueden incluir el método de aprendizaje de ADN genética molecular anteriormente. Su esencia es que, con el fin de identificar el material cadena de exploración de fragmentos específicos de DNA de patógenos. técnicas de diagnóstico de genética molecular aún no tienen una forma más eficiente para reconocer enfermedades tales como la tuberculosis. Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se puede estar seguro de que el ADN original se incrementará el número de copias en un millón de veces, es decir, no será la amplificación, y se mostrará los resultados. El nivel de sensibilidad es muy alta – más del noventa y cinco por ciento, que es la principal ventaja de este método.
El resto de los métodos de genética molecular de la investigación sobre la eficacia de rendimiento de múltiples copias literalmente se duplicó, ya que en este caso la muestra de redacción muestra una secuencia de oligonucleótido específica aumentó a ciento seis veces. Incluso el diagnóstico cultura de la tuberculosis del sistema respiratorio inferior significativamente su sensibilidad. Esta es la razón por la medicina moderna se basa en métodos genéticos moleculares de diagnóstico de la tuberculosis. Un método descrito es eficaz, especialmente cuando se trata de agentes patógenos de alta variabilidad antigénica, determinar que de otra manera es mucho más difícil – requiere especiales medios de cultivo y cultivar mucho tiempo. métodos genéticos bioquímicos y moleculares producen efecto muy diferente en los resultados.
diagnóstico de la tuberculosis
Marshall PCR diagnóstico de la tuberculosis más comúnmente usando aquellas secuencias de ADN que son específicos para los cuatro tipos de la enfermedad. Para lograr este objetivo a menudo utilizar cebadores que detectan secuencia de elementos IS (IS-986, IS-6110), ya que estos elementos caracterizan especies altamente migratorias Mycobacterium tuberculosis y siempre presentan múltiples copias en el genoma. También la extracción de ADN puede llevarse a cabo a partir de cultivos puros y Clínica (esputo de los pacientes) por cualquier otro método adecuado. Por ejemplo, el método de Boom allí donde se utiliza el tampón de lisis basado en el tiocianato de guanidina y sílice como el ADN portador. El número de pacientes que difieren pobres bacteriológica aumenta cada año, y por lo tanto en la práctica clínica ha establecido un nivel completamente diferente de organización: método genético-molecular de estudiar el ADN ha estado jugando un papel importante en el diagnóstico.
Sin embargo, hay que admitir que no está exento de inconvenientes. El método de PCR es el uso de la frecuencia trae un gran número de resultados falsos positivos, y la razón es no sólo errores técnicos, sino también las características del método en sí. Además, el uso de este método de diagnóstico para determinar la viabilidad de las micobacterias, que han sido identificadas, es sencillamente imposible. Sin embargo, esta desventaja no es el más importante. métodos genéticos moleculares de diagnóstico de PCR implican el riesgo de contaminación de ADN micobacteriano. Los requisitos de certificación por esta razón que para los laboratorios de PCR diseñado exclusivamente duro, se requieren tres locales separados. La tecnología PCR es moderno y muy compleja, que requiere el uso de equipo adecuado y personal altamente capacitado.
bacterioscopia
Cuando los resultados del diagnóstico de los análisis deben compararse con otros datos: examen clínico, la radiografía, la microscopía de frotis, cultivo e incluso respuesta a un tratamiento específico son muy importantes. En esta serie, los estudios de PCR es sólo uno de los componentes. Detectar el patógeno en el diagnóstico precoz pueden ser los métodos más simples y rápidas – bacteriológicos.
No se utiliza un microscopio de luz (coloración Ziehl-Neelsen) y fluorescentes (fluorocromos colorantes). La ventaja es la velocidad de frotis de los resultados. Sin embargo, su inconveniente es considerada con razón la capacidad limitada debido a la baja sensibilidad. Sin embargo, este método se da recomendaciones de la OMS como el más económico y el suelo para detectar pacientes con tuberculosis. La detección de método bacteriológico micobacterias tiene valor de predicción y estimado excreción cuantitativamente bacteriana. Mucho más segura para tratar con él los métodos de investigación de genética molecular de la tuberculosis.
culturas
Mejor detección de micobacterias reconocer los estudios culturales. Siembra de material patológico se hace en el medio de huevo: Mordovsky, Finn II, LJ, y similares. Los puntos de referencia de resistencia de las micobacterias a medicamentos y pruebas indirectas de la eficacia de una serie de micobacterias y sus colonias in vitro, si el método aplicado de la cultura de investigación. Para aumentar el porcentaje de aislamiento de la inoculación micobacterias de material patológico se lleva a cabo en múltiples entornos.
Satisfacer las necesidades de numerosos, incluyendo patógenos subvención y fluidos cultural. Utilizado en este sistema automatizado, y el tipo de medición del crecimiento VANTES. Los cultivos deben mantenerse en incubación durante un máximo de siete a ocho semanas. En ese momento el cultivo con la falta de crecimiento puede ser considerado negativo. La forma más eficaz para detectar Mycobacterium tuberculosis consideran muestras biológicas: conejillos de indias material de infectar de diagnóstico, que son extremadamente susceptibles a la TB.
algunas cifras
interesante campo de estudio, que fue abierto por el diagnóstico de PCR fue estudiar el M. tuberculosis – infección latente. El concepto moderno de la infección por tuberculosis sugiere que de cada cien personas que estuvieron en contacto con M. tuberculosis, noventa y bien puede estar infectado, pero sólo diez de ellos son se está desarrollando la enfermedad activa. Otros tienen la inmunidad de TB, y porque el noventa por ciento de los casos la infección permanece latente. Detectar un patrón que ha ayudado a un método genético molecular.
Los genetistas dicen que el cincuenta y cinco por ciento de las personas cuyos cultivos fueron negativos patológica de material, y el ochenta por ciento de las personas infectadas por M. tuberculosis, pero que fluye sin manifestaciones radiológicas de la enfermedad, PCR recibido respuestas positivas. Es un método de diagnóstico genético ayudado a identificar a los pacientes en riesgo por los estudios de PCR, con los resultados de sus análisis (microscopía y cultivo) fueron negativos, y la infección subclínica M. tuberculosis estaba presente.
la investigación moderna
La Federación Rusa y laboratorios bacteriológicos utilizan un método acelerado de las concentraciones absolutas: actividad de la reductasa de nitrato de micobacterias ensayadas por el reactivo de Griess. centros Anti-TB utilizar un método que permite determinar la resistencia a fármacos. Esta siembra en medios líquidos, donde automatizado radiométrica y sistema de contabilidad fluorescente crecimiento de micobacterias. Dicho análisis se realiza de forma rápida – hasta dos semanas.
Actualmente, se están desarrollando nuevos métodos: resistencia a los fármacos de micobacterias se mide a nivel de genotipo. Estudio de los mecanismos moleculares de genes de resistencia y muestra la presencia en micobacterias. Estos genes están asociados con la resistencia a ciertos fármacos. Por ejemplo, los genes KaSa, INHA, resistentes a la isoniazida, el gen rpoB katG – genes de ARN 16SP rifampicina y rpsL – estreptomicina, emb1 – a etambutol, gyrA – una fluoroquinolona y así sucesivamente.
mutaciones
El diagnóstico moderno aumentó significativamente el método nivel genético-molecular para el estudio de ADN y se deja llevar a cabo estudios a gran escala de mutaciones en todo su espectro. Ahora sabemos que las mutaciones más comunes en los 516, 526 y 531 codones del gen rpoB, e identificó la resistencia a varios fármacos. Hay toda una serie de métodos para la tipificación de micobacterias utilizando no sólo los métodos tradicionales – bioquímicos, biológicos y culturales, sino también ampliamente utilizado técnicas de genética molecular moderna. Ya hay adecuada y proporcionan el método diagnóstico correcto para la detección de enfermedades monogénicas. Se basan en estudios de ADN en el área exacta de un gen particular. Esto suele ser un proceso complejo, largo y costoso, pero los datos que es proporcionada por el análisis genético molecular, es mucho más preciso e informativo de los datos de todos los demás análisis.
Durante mucho tiempo se ha sabido que el ADN no cambia durante toda la vida del organismo que está en cualquier células odnakova nucleado, y esto hace que sea posible tomar el análisis de absolutamente todas las células del cuerpo, en cualquier etapa de la ontogenia. El gen dañado se puede detectar antes de la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad clínica a gran escala, así como en personas sanas heterocigóticos, pero que tienen una mutación en el gen. métodos de diagnóstico de enfermedades hereditarias de genética molecular permiten revelar sus (enfoque directo, ADN-diagnóstico), así como para analizar la segregación de la enfermedad en la familia con ADN marcador loci (polimorfismos genéticos), que están estrechamente vinculadas con un gen dañado (es decir, el enfoque indirecto de ADN-diagnóstico). Directa o indirectamente – cualquier diagnóstico de ADN se basa en los métodos de identificación de una parte estrictamente definida del ADN humano.
métodos directos
Los métodos directos de diagnóstico de ADN son cuando se conoce la enfermedad hereditaria gen culpable, como es bien conocido, y los tipos de sus mutaciones. Por ejemplo, un métodos directos adecuados en un número de enfermedades. Este corea de Huntington (CTG extensión repeticiones), fenilcetonuria (R408W), la fibrosis quística (delta F508, mutaciones importantes) y similares. La principal ventaja del método directo es una exactitud diagnóstica de propiedad total, y no hay necesidad de hacer un análisis de ADN del resto de la familia. Si se encuentra una mutación en el gen correspondiente, que permite aprobar exactamente un diagnóstico de la herencia, la determinación del genotipo para el resto de la familia cargado.
Otra ventaja de un diagnóstico directo se considera para identificar un portador heterocigoto de malas mutaciones de los familiares y los padres que murieron de la enfermedad. Esto es especialmente cierto para las enfermedades autosómicas recesivas. Desventajas de los métodos directos también están disponibles. Para aplicarlas, lo que necesita saber exactamente localizar el gen anormal, el exón-intrón estructura de su espectro y sus mutaciones. No todas las enfermedades monogénicas hoy han recibido dicha información. métodos directos Informatividad no puede considerarse completa, porque uno y el mismo gen puede tener un gran número de mutación patológica que causa el desarrollo de enfermedades hereditarias.
métodos indirectos
Los métodos indirectos en el diagnóstico de ADN se utilizan en absoluto, en otros casos, si el gen dañado no se identifica, pero sólo cromosómicamente, o si el diagnóstico línea no dio el resultado (es el caso, si la organización molecular complejo de genes o en gran medida, si hay una gran cantidad mutaciones patológicas). Los métodos indirectos realizaron análisis de segregación de los marcadores polimórficos en la familia alélica. Los marcadores que se encuentran en la misma región cromosómica o locus está estrechamente ligada a la enfermedad y representan deleciones o inserciones, sustituciones puntuales, repeticiones, y su polimorfismo es debido a la diferente cantidad de células en el bloque.
Más conveniente para el diagnóstico considerado microsatélites y polimorfismos minisatélite indirectos, que están ampliamente distribuidos en el genoma humano. su valor se expresa en alto contenido de información, si el daño a la distancia genética entre el marcador y el gen no es demasiado grande. En el último caso, la precisión de la estimación se determina en gran medida la frecuencia de recombinación entre el marcador polimórfico y daños. métodos de diagnóstico indirectos también proporcionan paso preliminar obligatorio de las frecuencias alélicas de la población de estudio analizados entre los pacientes y portadores de mutaciones, además de la necesidad de determinar la probabilidad de recombinación de no equilibrio y adherencia marcadores y alelos mutantes.
otros métodos
segmentos cortos de ARN o ADN, así como un solo gen visualizados en estudio microscópico no pueden ser, por lo tanto, para identificar mutaciones necesarias por diagnóstico genético molecular. Hay un "Proyecto Genoma Humano", así como otros avances en genética molecular ampliado en gran medida la posibilidad de que el diagnóstico de enfermedades hereditarias – pre y postnatal. Estos métodos pueden proporcionar la detección temprana y hacer una poli- predicción y enfermedades monogénicas, cuyo debut tiene lugar en la edad adulta. Desafortunadamente, debido a las capacidades técnicas de los estudios de genética molecular son a veces más allá de los límites éticos que se establecen en relación con la herencia, sobre todo cuando el diagnóstico es en la adolescencia y la niñez.
anomalías cromosómicas estructurales y numéricas son las causas más comunes de la enfermedad y el cáncer, y muchas malformaciones. Las aberraciones cromosómicas deben ser identificados, lo cual es importante para la orientación familiar – para evaluar el pronóstico, junto con riesgo reproductivo en embarazos futuros. El análisis cromosómico es el "patrón oro" del diagnóstico genético, pero es limitada. Sólo los métodos de análisis genético molecular pueden hacer más, porque no utiliza la clonación de marcadores fluorescentes basado tecnología capaz de su alta sensibilidad para identificar los cambios cromosómicos sutiles que son imposibles de detectar clásicos estudios citogenéticos. Estas técnicas se están expandiendo cada vez más nuestras capacidades de diagnóstico, cuando se examina, los niños con discapacidades del desarrollo, retraso mental, con muchas otras enfermedades hereditarias.
hallazgos
Es muy importante para la humanidad eran la estructura del gen y la función del conocimiento, tipos de variabilidad, la capacidad de detectar enfermedades hereditarias que se produjeron en relación con el desarrollo de la genética molecular. sus métodos están dirigidos al estudio de la molécula de ADN – y cuando es normal, y cuando esté dañado. Preparación de secuencias de ácidos desoxirribonucleicos de nucleótidos (ADN) se extiende en las etapas de recibir muestras para identificar fragmentos individuales. Aislamiento de ADN genómico a partir de las células, de restricción (lagrimeo), amplificación (clonación), electroforesis de los fragmentos (que separa su carga eléctrica y peso molecular por electroforesis en gel de agarosa). Identificación de fragmentos específicos localizados en la superficie de una banda discreta.
Luego de entrar en los filtros especiales acto, a través del cual pasa cada hibridación fragmento con fragmentos de ADN clonados o sondas radiactivas sintético es un control, que será igual a cada muestra de prueba. Si cambia la posición o la longitud en comparación con la sonda, si un nuevo fragmento o desaparecido – todo esto sugiere que el gen analizado ha sido objeto de la reestructuración en la secuencia de nucleótidos. Hay ocho técnicas básicas de estudios de genética molecular: de secuenciación (Determinación de la secuencia de ADN), reacción en cadena de la polimerasa (aumento en el número de secuencias), la preparación de cebadores conocidos genes, la clonación de ADN, la producción de moléculas recombinantes derivadas de proteínas debido a moléculas recombinantes, la creación de un conjunto completo (colección biblioteca) fragmentos que se obtuvieron mediante el uso de restricción clonado.
